23S
rRNA的
相对分子质量约为1.2 MDa，长度约为2900 nt，分子一半以上核苷酸以分子内双链形式存在，产生超过100个螺旋。 它在
70S核糖体的50S亚基中与
核糖体蛋白质L1、L2、L3、L4、L9和L23结合形成初级复合物。对紧密状态下23S rRNA的电镜研究表明，23S rRNA的形状与50S核糖体亚基相似。
23S rRNA是核糖体催化功能的核心，其
结构域Ⅴ具有
肽酰转移酶活性。位于核糖体P位点的23S rRNA部分有特定区域能与进入核糖体的tRNA形成互补碱基对。
P位点的23S rRNA部分是
大环内酯类抗生素的作用靶位，该类抗生素通过与23S rRNA阻碍肽链延伸。但一些细菌可利用erm基因介导23S rRNA
甲基化酶使23S rRNA的甲基化，从而降低核糖体对抗生素的亲合性；也有细菌能通过核糖体变构来影响抗生素作用。